Revista  Enfermagem Atual

Nosso contato
enfermagematual2017@gmail.com
+55 (21) 2259-6232
Nosso endereço
[ISSN 1519-339X ] Impressa
Rua México, 164, SALA 62
Centro | RJ - 20031-143

Avaliação antibacteriana e tóxica da espécie Cordia nodosa cham.: PERSPECTIVA no tratamento de feridas infectadas

Evaluation of antibacterial and toxic species Cordia nodosa Cham .: Perspectiva in the treatment of infected wounds
  • Raíssa Fernanda Evangelista Pires dos Santos
  • Isabelle Souza de Mélo Silva
  • Kátia Mayumi Takarabe Caffaro
  • Regina Célia Sales Santos Veríssimo
  • Thais Honório Lins
  • João Xavier de Araújo-Júnior
  • Lucia Maria Conserva
  • Eliane Aparecida Campesatto
  • Maria Lysete de Assis Bastos

Pesquisa realizada com apoio financeiro da Fundação de amparo à Pesquisa no Estado de alagoas/FaPEaL e do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e tecnológico/CNPq.


RESUMO

RESUMO: O Brasil detém uma das maiores biodiversidades do planeta, no qual o uso popular de plantas medicinais tornouse fonte para descoberta de novos compostos ativos. Porém, o conhecimento popular deve relacionar-se à realização de bioensaios que comprovem a eficácia terapêutica e a baixa toxicidade das plantas. A integração da enfermagem na descoberta de novos fitoterápicos é uma das muitas contribuições dessa área da saúde agregando a pesquisa básica com a área assistencial. O objetivo do estudo foi avaliar a atividade antibacteriana e tóxica da C. nodosa, na perspectiva de tratar feridas infectadas. As amostras foram submetidas à triagem preliminar, pela difusão em disco, com S. aureus e S. epidermidis evidenciando sensibilidade à fração acetato de etila e ao extrato etanólico do caule. As amostras foram levadas à determinação da Concentração Inibitória Mínima, demonstrando ação inibitória do extrato etanólico do caule frente ao S. epidermidis e S. aureus na concentração de 125 e 1000 µg mL-1, respectivamente. O Teste de toxicidade frente à Artemia Salina identificou ausência de toxidez nas amostras avaliadas. O melhor resultado foi com o extrato etanólico do caule frente ao S. epidermidis, apontando perspectivas para desenvolvimento e inovação de alternativas na terapêutica de feridas infectadas.

Descritores: Cordia nodosa; Atividade Antimicrobiana; Plantas Medicinais.


SUMMARY - Brazil has one of the greatest biodiversity on the planet, where the popular use of medicinal plants has become a source for discovering new active compounds. However, popular knowledge must relate to the performance of bioassays demonstrating the therapeutic efficacy and low toxicity of the plants. The integration of nursing in the discovery of new herbal is one of the many contributions that health aggregating basic research with the care area. The aim of the study was to evaluate the antibacterial activity of toxic and C. nodosa, the perspective of treating infected wounds. The samples were subjected to preliminary screening by disk diffusion with S. aureus and S. epidermidis showing sensitivity to ethyl acetate fraction and the ethanol extract of the stem. The samples were taken to determine the minimum inhibitory concentration, demonstrating the inhibitory action of ethanol extract of the stem against S. epidermidis and S. aureus at a concentration of 125 and 1000 µg mL-1, respectively. The opposite pattern of toxicity Artemia salina identified no toxicity were shown. The best result was with the ethanol extract of the stem against S. epidermidis, indicating prospects for development and innovation of alternative therapy in infected wounds.

Cordia nodosa; Antimicrobial Activity; Medicinal Plants.

INTRODUÇÃO

O sistema tegumentar, formado pela pele e anexos é responsável pela interface entre o corpo e o ambiente estando sujeito às adversidades ambientais, como a agressão por agentes físico, químico ou biológico, que promovem sua ruptura e caracterizam a ferida. Seu processo de cicatrização consiste em promover a reepitelização e a reconstituição do tecido. Porém, alguns fatores poderão alterar este processo, como a infecção da ferida. A infecção, por sua vez, caracteriza-se por um efeito debilitante, causado por um agente patogênico (vírus, bactérias, fungos ou parasitos) que poderá penetrar, se desenvolver e multiplicar no organismo do hospedeiro1.

Uma das razões pela qual há falha na terapêutica para tratar pacientes portadores de infecções bacterianas é o surgimento de bactérias resistentes aos antibióticos, ocasionadas pelo seu uso indiscriminado. A infecção das feridas se encaixa nesta problemática, visto que compreendem um dos fatores que retardam o processo cicatricial e promovem um dano tecidual mais acentuado, pela maior suscetibilidade, ocasionada pelo fechamento lento e insuficiente2. Em decorrência deste problema, a busca por novas substâncias antimicrobianas a partir de produtos naturais tem aumentado o interesse das empresas farmacêuticas e de pesquisadores de diversas áreas, inclusive da enfermagem, por espécies utilizadas na medicina popular. Avaliação

O Brasil, país de maior biodiversidade do planeta, com sua rica diversidade étnica e cultural é detentor de um valioso conhecimento tradicional e empírico associado ao uso de plantas medicinais. Sendo assim, tem um grande potencial para desenvolvimento de pesquisas que resultem em tecnologias e terapêuticas apropriadas no tratamento de feridas infectadas com uso de plantas. No intuito de estabelecer as diretrizes para a atuação na área de plantas medicinais e fitoterápicos, o governo federal implementou em 2006 a Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, que se constitui parte essencial das políticas públicas de saúde, meio ambiente, desenvolvimento econômico e social capaz de promover melhorias na qualidade de vida da população brasileira 3.

A integração da enfermagem em pesquisas com plantas medicinais na descoberta de novos fitoterápicos é uma das muitas contribuições da enfermagem na intersecção da pesquisa básica com a área assistencial, uma vez que é o principal facilitador do cuidado4.

Pesquisas experimentais in vitro desenvolvidas por enfermeiros da Universidade Federal do Ceará que atuam em projetos para o desenvolvimento de novas tecnologias para o tratamento de feridas avaliou o uso de uma cobertura de colágeno e Aloe vera no tratamento de ferida isquêmica, que evidenciou boa tolerabilidade e eficácia terapêutica5. Úlceras crônicas, infectadas e recorrentes em membros inferiores, de pessoas curadas de hanseníase, foram analisadas por enfermeiros quanto à comparação da ação de uma biomembrana de látex (Biocure®) e de um produto à base de AGE – Ácidos Graxos Essenciais (Dersani®), que demonstraram efeito antimicrobiano sobre E. aerogenes e P. aeruginosa, respectivamente. Também foi identificado que os microrganismos mais prevalentes em feridas cutâneas foram S. aureus, P. aeruginosa, P. vulgaris, E. aerogenes e E. coli6.

A planta testada neste estudo, pertence à família Boraginaceae (Dicotyledonae), descrita por Antoine Laurent de Jussieu, que inclui 130 gêneros distintos, com aproximadamente 2.300 espécies, sendo os gêneros mais importantes: Cordia, um dos mais comuns no Brasil; Heliotropium; Cynoglossum; Borago e Symphytum. Além disso, possui inúmeras espécies consideradas medicinais, porém, muitas delas ainda não foram comprovadas cientificamente. As principais substâncias encontradas nessa família são alcalóides, quinonas, naftoquinonas, saponinas, taninos, ácidos fenólicos, alantoínas, mucilagens, polissacarídeos, flavonóides, ciclitóis e ácidos graxos de interesse terapêutico e nutricional, como o ácido gamalinolênico7.

O gênero Cordia foi descrito por Linnaeus em 1753, no Brasil, a região Nordeste se sobressai e engloba sete gêneros e cerca de 70 espécies. Além disso, tem sido usado na medicina popular no tratamento de úlceras gástricas, como antiinflamatório, no tratamento de tumores, sendo ainda utilizadas como anti-reumática e hemostática8. Plantas medicinais com atividade candidíase estudadas no Brasil nos últimos dez anos, incluem a Cordia nodosa, porém, os trabalhos no que dizem respeito à atividade antibacteriana são escassos9.

Visto que espécies do gênero Cordia, popularmente conhecida como grão-de-galo, apresentam promissoras ações antimicrobianas e sabendo do potencial que o Brasil apresenta como fonte de matérias-primas de origem vegetal, este trabalho buscou avaliar o potencial antibacteriano e tóxico in vitro de extratos de Cordia nodosa Cham.

MÉTODOS

Pesquisa básica de caráter quantitativo e experimental in vitro, no qual condições biológicas são simuladas em laboratório, para avaliar o potencial antimicrobiano de uma espécie vegetal, bem como gerar novos conhecimentos para o avanço da ciência.

Obtenção do Material vegetal

Foram coletadas amostras das folhas, caule e cascas do caule de Cordia nodosa em uma propriedade no município de Marechal Deodoro em Alagoas. A identificação foi feita por uma botânica do Instituto do Meio Ambiente do Estado de Alagoas (IMA), onde exsicata do referido material encontra-se depositada em seu Herbário, com a identificação MAC nº 14.904.

As serragens dos materiais vegetais (folhas, caule e cascas do caule) obtidas após secagem a temperatura ambiente e trituração, foram individualmente extraídas, através da maceração com etanol (EtOH) a 90%. Após concentração das soluções em evaporador rotatório, obtiveram-se três extratos. Desses separou-se uma parte do extrato das folhas e outra do extrato do caule, para extração líquido/líquido pelo método da partição em funil de separação. Assim, parte dos extratos das folhas e do caule foram suspensos em uma solução de metanol-água [MeOH-H2O (3:2)] e extraídos sucessivamente em hexano (C6H14), clorofórmio (CHCl3) e acetato de etila (AcOEt). Foram avaliados na presente pesquisa quatro amostras, quais sejam: as frações em AcOET das folhas e do caule, o extrato etanólico das cascas do caule. Toda a parte fitoquímica foi realizada no Laboratório de Pesquisa em Produtos Naturais do Instituto de Química e Biotecnologia (IQB) pertencente à Universidade Federal de Alagoas (UFAL).

Linhagens microbianas

As linhagens bacterianas utilizadas neste estudo foram padronizadas pela American Type Cell Cellection – ATCC/Manassas-VA/USA e CEFAR diagnóstica Ltda., São Paulo. Foram avaliadas as bactérias Gram-positivas: Staphylococcus aureus (ATCC 25923) e Staphylococcus epidermidis (CCCD 14990).

A microbiota encontrada em feridas cutâneas infectadas guiou a escolha dos microrganismos avaliados nesta pesquisa. Sabe-se que a microbiota transitória dependerá da localização da ferida e poderão ser encontradas na pele exposta, que, por vezes, é incapaz de crescer e se multiplicar, ao passo que podem variar conforme a espécie, o número de microrganismos e a localização da ferida, podendo persistir6.

Testes antimicrobianos

Para avaliação da sensibilidade microbiana frente à espécie C. nodosa foi realizado o teste de difusão em disco, no qual uma amostra de 100 mg de cada amostra foi solubilizada em EtOH, para obtenção de soluções estoques nas concentrações 2.000 µg mL-1. No teste quantitativo para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) da amostra, responsável por inibir o crescimento microbiano, uma amostra 2 mg de cada amostra foi solubilizada em Dimetilsufóxido (DMSO) a 10%, alcançando a mesma concentração estoque utilizada no teste qualitativo de difusão em disco de 2.000 µg mL-1.

Para a avaliação qualitativa da atividade antibacteriana foram preparados inóculos, correspondente a cada linhagem investigada, a partir das suas suspensões em Solução Salina Tamponada (SST). A solução foi preparada de acordo com a turbidez do frasco nº 5, da escala de MacFarland, correspondendo a 1,5 x 108 Unidades Formadoras de Colônias (UFC) mL-1, considerado o padrão de turvação para determinação da carga microbiana. Em seguida este inóculo padronizado foi semeado de maneira uniforme na superfície de placas de Petri com Ágar Mueller-Hinton (AMH) esfregando-se um swab de algodão estéril em três sentidos, horizontal, vertical e diagonal; e por três vezes, girando a placa em 6010.

Discos de papel Whatman nº.1 estéreis, de 6 mm de diâmetro, foram impregnados com 20 µL das soluções estoques provenientes das amostras vegetais nas concentrações 2.000 µg µL-1. Após a secagem os mesmos foram pressionados contra a superfície do meio de cultivo contendo o inóculo, previamente semeado, garantindo a difusão das amostras e o contato com os microrganismos. Posteriormente, estas placas foram acondicionadas em estufa bacteriológica por 24 horas a 35 °C.

Os resultados foram mensurados por meio de um paquímetro. Instrumento utilizado para medir a área, em milímetros, sem crescimento microbiano detectável a olho nu, chamado de halo de inibição. Para a análise dos resultados adotou-se o seguinte critério: halo de inibição inferior a 9 mm as amostras foram consideradas inativas; entre 9-14 mm, moderadamente ativas; maior que 14 e inferior a 17 mm, ativas; e maior que 17 mm, muito ativas. Os bioensaios foram realizados em triplicata11.

O controle positivo, que evidencia a viabilidade bacteriana, seguiu o proposto pelo Clinical Laboratory Standards (CLSI)12. Como controle positivo foi usado Ceftriaxona (30 µg/disco).

Para a determinação da CIM, o inóculo de 1,5 x 108 UFC mL-1 foi rediluído numa proporção de 1:10 (volume/volume) para obter a concentração padrão utilizada (104 UFC mL-1)12 A CIM foi realizada em microplacas de poliestireno estéreis de 96 poços, com 12 colunas (1 a 12) e 8 linhas (A a H). Um volume de 200 µL da solução estoque na concentração de 2.000 µg mL-1 das diversas amostras vegetais foi inoculado, em triplicata, nas colunas de 1 a 9 da linha A. Os demais orifícios a partir da linha B foram preenchidos com 100 µL de caldo Brain Heart Infusion (BHI) duplamente concentrado.

Uma alíquota de 100 µg mL-1 do conteúdo de cada orifício da linha A foi transferido para os orifícios da linha B, e após homogeneização o mesmo volume foi transferido para a linha C, repetindo-se até a linha H, desprezando-se o excesso da diluição. Obtiveram-se assim concentrações decrescentes das amostras testadas (1.000 µg mL-1; 500 µg mL-1; 250 µg mL-1; 125 µg mL-1; 62,5 µg mL-1; 31,25 µg mL-1; 15,62 µg mL-1). Posteriormente, em cada orifício foi adicionado 5 µL de inóculo microbiano. Para o controle da viabilidade bacteriana utilizou-se o caldo BHI e o inóculo microbiano (5 µL); o controle negativo foi avaliado por meio da atividade inibitória do diluente DMSO a 10%; e para o controle de esterilidade utilizou-se apenas o caldo BHI.

Em seguida, estas placas foram incubadas em estufa bacteriológica a 35ºC por 18 horas, para bactérias. Após este período, foram adicionados 20 µL de Cloreto de Trifeniltetrazólio (TTC) (5% v/v) em cada poço, e as placas foram reincubadas. Esta substância provoca a mudança de incolor para coloração vermelha quando há a presença de microrganismos. O grau de atividade foi determinado segundo os seguintes critérios: CIM ≤ 100 µg mL-1 (ativa); 100 < CMI ≤ 500 µg mL-1 (moderadamente ativa); 500 < CMI ≤ 1000 µg mL-1 (baixa atividade); e CIM ≥1000 µg mL-1 (inativos)11.

Toxicidade frente Artemia salina Leach

Para a avaliação da toxicidade das amostras frente à Artemia salina, um microcrustáceo de água salgada comumente usada como alimento para peixes. Porém, também é utilizado em laboratório para experimentos in vitro preliminares para determinar a toxicidade de extratos e produtos de origem natural com potencial ativo biológico13.

Uma solução estoque de 5 mg (5.000 µg mL-1 da amostra da C. nodosa) foi dissolvida com o solvente DMSO a 10%. O controle positivo foi uma solução de timol a 1% e o negativo a água do mar com o solvente que solubilizou a amostra. O timol a 0,01% foi utilizado como controle positivo e sua atividade artemicida, encontra-se na sua capacidade de romper a membrana citoplasmática e consequentemente levar as larvas de A. salina à morte por desidratação.

As amostras foram testadas nas concentrações de 1.000, 100, 10 e 1 µg mL-1, em triplicata, na qual, alíquotas da solução estoque foram aplicadas nestes de tubos de ensaio para secar previamente. Em seguida foram adicionados 1 mL de A. salina, contendo 10 larvas e mais 1,5 mL de água do mar. Após 24 horas realizou-se a leitura do experimento.

Os extratos e frações que promoverem mortalidade < que 30% na concentração de 1.000 µg mL-1 foram considerados atóxicos e aqueles com mortalidade ≥ 30% nesta concentração foram submetidos ao ensaio quantitativo14. Nestes ensaios os valores de concentração letal (CL50) também foram avaliados conforme preconizado por Déciga-Campos et al.14. Estes autores consideram comos atóxicos as amostras com CL50 ≥ 1000 µg mL-1; com baixa toxicidade - CL50 ≥ 500 e < 1000 µg mL-1; e altamente tóxico se CL50 < 500 µgmL-1.

RESULTADOS

As frações e os extratos da espécie C. nodosa demonstraram atividade bacteriana frente às bactérias Gram-positivas: S. aureus e S. epidermides no teste de difusão em disco (Tabela 1). Frente à linhagem de S. aureus, apenas o extrato etanólico do caule apresentou-se ativo, com halo de inibição igual a 15 mm (Figura 1). A fração AcOEt do caule também inibiu o crescimento deste microrganismo, com um halo de inibição inferior a 9 mm, ou seja, houve uma pequena sensibilização. Porém, frente à linhagem de S. epidermidis, tanto o extrato etanólico quando a fração AcOEt do caule inibiram de forma moderadamente ativa (halos de inibição = 10mm, conforme Tabela 1).

TABELA 1. Atividade antibacteriana de extratos etanólicos e frações da Cordia nodosa. Maceió/AL, 2014.

Com base no teste de difusão em disco, apenas o extrato em EtOH e a fração em AcOEt do caule foram avaliadas quanto a determinação da CIM, visto que foram as únicas amostras que evidenciaram atividade antibacteriana frente às linhagens de S. aureus e S.epidermidis. O extrato etanólico do caule inibiu o crescimento da linhagem de S. aureus na concentração de 1000 µg mL-1. Porém, frente à linhagem de S. epidermides a inibição foi até a concentração de 125 µg mL-1, indicando um potencial promissor, com ação moderadamente ativa. A fração AcOEt do caule não inibiu o crescimento da linhagem de S. epidermidis, indicando que a CIM foi superior a 1.000 µg mL-1.

Teste de Toxicidade frente à Artemia Salina (TAS)

No TAS preliminar realizado nesta pesquisa identificou-se a ausência de toxicidade em todos os extratos da espécie estudada (percentual de mortalidade ≤30%). Este achado dispensou a realização do ensaio quantitativo, e consequentemente a determinação CL50.

TABELA 2. Extratos e frações de C. nodosa submetidas ao Teste de Toxicidade frente à A. Salina. Maceió/AL, 2014.

DISCUSSÃO

A fração em AcOET e extrato em EtOH do caule da espécie C. nodosa demonstraram atividade frente a S. aureus e S. epidermidis foram considerados atóxicos.

O S. aureus é o patógeno humano mais importante do gênero Staphylococcus e faz parte da microbiota normal da pele e mucosa de uma grande parte de mamíferos. Uma das características mais relevantes deste gênero é determinada pela prova da coagulase, visto que bactérias que a produzem são capazes de promoverem uma reação de coagulação15.

Ensaios que avaliam a atividade inibitória de extratos vegetais contra as espécies pertencentes ao gênero Staphylococcus requerem maior aprofundamento e resultados promissores que revelam atividade biológica das plantas devem ser bem explorados16. Diante desta indicação da literatura podese afirmar que a continuação de estudos com a C. nodosa deve ser ampliados, visando o isolamento de princípios ativos, nas amostras testadas para a descoberta de novos fitoterápicos ou de fármacos.

Em um estudo realizado por Matias, Santos e cols.17 os extratos em MeOH e C6H14 de outra espécie do gênero Cordia, a Cordia verbenácea foram avaliados para atividade antibacteriana frente às linhagens de Escherichia coli e Staphylococcus aureus e inibiram o crescimento microbiano. Os valores da CIM variaram de 128 a ≥ 1.024 µg mL-1, o que revelam a presença de componentes ativos em espécies do gênero Cordia que corroboram com o uso popular de espécies deste gênero para cura de doenças infecciosas da pele. Estes resultados corroboram com os achados da presente pesquisa, no que diz respeito à ação frente à linhagem de S. aureus.

A espécie Cordia dichotoma também evidenciou atividade antimicrobiana18, bem como, diversas espécies de Cordia spp evidenciaram atividade bactericida frente a Streptococcus mutans e Streptococcus sanguinis19, o que contribui para reforçar as evidências da presente pesquisa.

No teste de toxicidade TAS (preliminar) foi identificado a ausência de toxidez em todas as amostras da espécie estudada (percentual de mortalidade ≤ 30%), dispensando a realização do ensaio quantitativo, e consequentemente a determinação CL50. Isso significa que as concentrações testadas estavam abaixo da CL50 de cada extrato ou fração. Um estudo estabeleceu uma relação entre o grau de toxicidade e a dose letal média, CL50, apresentada por extratos de plantas sobre larvas de A. salina, desde então, consideraram que quando são verificados valores acima 1.000 µg/mL, estes, são considerados atóxicos14.

Esses dados demonstram a ausência de toxidez, indispensável para uso seguro, elegendo esse extrato à condição de promissor, para ser avaliado quanto ao seu potencial biológico, uma vez que a ausência de toxicidade diz respeito aos efeitos adversos que o extrato possa vir a apresentar. Nos estudos de plantas e de novas substâncias, um balanço entre a atividade biológica versus a toxicidade é um parâmetro fundamental para verificar sua aplicabilidade.

CONCLUSÃO

Estes resultados representam os primeiros indícios de segurança de C. nodosa para que a mesma venha a ser avaliada em bioensaios in vivo em modelos animais de pequeno porte, visto que apresenta ausência de toxicidade. Além disso, as amostras provenientes do caule evidenciaram promissor potencial bactericida frente S. aureus e S. epidermidis.

Cabe enfatizar a importância dos resultados obtidos com a avaliação da espécie C. nodosa na perspectiva do desenvolvimento e inovação de novas alternativas na terapêutica de feridas cutâneas infectadas por bactérias. Valorizando-se assim a cultura e a tradição popular no uso de plantas medicinais que promovam à incorporação de novos conhecimentos científicos, bem como o desenvolvimento de pesquisas inéditas com esta espécie, com a perspectiva no controle de infecção de feridas.

Referências

1 Carneiro MIS, Ribas Filho JM, Marcondes J, Malafaia O, Ribas CAPM, Santos CA, et al. Estudo comparativo do uso de extrato de Pfaffia glomerata e do laser de baixa potência (hélio-neônio) na cicatrização de feridas em ratos. ABCD - Arq Bras Cir Dig. 2010; 23(3):163-7.

2. Oliveira BGRB, Araújo JO, Lima FFS, DI Piero KC. Avaliação clínica de úlceras cutâneas em cicatrização: um estudo prospectivo. Rev Enferm Atual. 2012; 63 14-7.

3. Brasil, MS. A fitoterapia no SUS e o Programa de Pesquisa de Plantas Medicinais da Central de Medicamentos – Brasília: Ministério da Saúde, 2006. [Acesso em: 24 Abr. 2014]; Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/ fitoterapia_no_sus.pdf

4. Alves LMM, Nogueira MS, Godoy S, Cárnio EC. Pesquisa básica na enfermagem. Rev Latino-am Enfermagem. 2004; 12(1):122-7.

5. Oliveira SHS, Soares MJGO, Rocha OS. Uso de cobertura com colágeno e Aloe vera no tratamento de ferida isquêmica: estudo de caso. Rev Esc Enferm USP. 2010; 44(2):346-51. [acesso em: 25 Set. 2013]; Disponível em: http://www.scielo.br/pdf/reeusp/v44n2/15. pdf

6. Quege GE, Bachion MM, Lino Junior RS, Lima ABM, Ferreira PS, Santos QR, Pimenta FC. Comparação da atividade de ácidos graxos essenciais e biomembrana na microbiota de feridas crônicas infectadas. Rev. Eletr. Enf. [Internet]. 2008; 10(4):890-905. [acesso em: 27 Abr. 2014]. Disponível em: http://www.fen.ufg.br/revista/v10/n4/v10n4a02.htm

7. Kuroyanagi M, Seki T, Hayashi T, Nagashima Y, Kawahara N, Sekita S, Satake M. Anti-androgenic triterpenoids from Brazilian medicinal plants. Chem Pharm Bull., 2001;.49(8):954-7.

8. Barroso ICE, Oliveira F, Branco LHZ, Kato ETM, Dias TG. O gênero Cordia L.: botânica, química e farmacologia. Lecta –USF. 2002; 20(1):15-34.

9. Costa JBP, Maranhão CA, Santos JC, Silva LLD, Nascimento MS. Avaliação da atividade antimicrobiana e estudo fitoquímico das raízes de Cordia nodosa. In: Anais do XVII Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil; 2002; Cuiabá ; 2002. p. 150.

10. Sangetha SN, Zuraini Z, Sasidharan S, Suryani S. Antimicrobial activities of Cassia surattensis and Cassia fistula. J Mol Bio Biotech. 2008;1(1):1-4.

11. Ayres MCC, Brandão MS, Vieira-Junior GM, Menor JCAS, Silva HB, Soares MJS, Chaves MH. Atividade antibacteriana de plantas uteis e constituintes químicos da raiz de Copernicia prunifera. Rev. bras. farmacogn. 2008; 18(1):90-7.

12. CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. Document M02-A11. Approved Standard — 11.ed.. Wayne. PA: Clinical and Laboratory Standards Institute, 2012.

13. Luna JS, Santos AF, Lima MRF, Omena MC, Mendonça FAC, Bieber LW, Sant’Ana AEG. A study of the larvicidal and molluscicidal activities of some medicinal plants from northeast Brazil. J Ethnopharmacol. 2005; 97(2):199-206. [acesso em: 27 Jan. 2014]. Disponível em: http://www.fcfar.unesp.br/revista_pdfs/vol29n2/ trab28.pdfSantos, R. F. E. P. dos; Silva, I. S. de M.; Caffaro, K. M. T.; Veríssimo, R. C. S. S.; Lins, T. H.; Araújo, J. X. de - Júnior; Conserva, L. M.; Campesatto, E. A.; Bastos, M. L. de A.;

14. Déciga-Campos M, Rivero-Cruz I, Arriaga-Alba M, Castañeda-Corral G, Angeles-López GE, Navarrete A, Mata R. Acute toxicity and mutagenic activity of Mexican plants used in traditional medicine. J Ethnopharmacol. 2007; 110(2):334-42.

15. Devriese LA, Vancanneyt M, Baele M, Vaneechoutte M, De Graef E, Snauwaert C, Cleenwerck I, Dawyndt P, Swings J, Decostere A, Haesebrouck F. Staphylococcus pseudintermedius sp. Nov., a coagulase-positive species from animals. Int J Syst Evol Microbiol. 2005; 55(4):1569-73.

16. Chandrasekaran M, Venkatesalu V. Antibacterial and antifungal activity of Syzygium jabolanum seeds. J. Ethnopharmacol. 2004; 9(1):105-8.

17. Matias EFF, Santos KKA, Almeida TS, Costa JGM, Coutinho HDM. Atividade antibacteriana In vitro de Croton campestris A., Ocimum gratissimum L. e Cordia verbenacea DC. R. bras. Bioci. 2010; 8(3):294-8.

18. Pankaj B N, Nayan RB, Shukla VJ, Acharya RN. Antimicrobial and antifungal activies of Cordia dichotoma (Forster F) bark extracts. 2011; 32(4):585-9.

19. Silva JPC. Avaliação in vitro da atividade de extratos de plantas da amazônia e mata atlântica frente à Streptococcus mutans e à Streptococcus sanguinis. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Odontologia da Universidade Paulista – UNIP. São Paulo; 2009.