![](3D"1247-Textodoartigo-PTHTML_arquivos/image002.jpg")
Fonte: Resultados da pesquisa.
AVALIAÇÃO DA TERAPIA
FOTODINÂMICA MEDIADA POR AZUL DE METILENO NA CICATRIZAÇÃ=
;O:
ESTUDO EXPERIMENTAL IN VIVO
EVALU=
ATION
OF METHYLENE BLUE MEDIATED PHOTODYNAMIC THERAPY IN WO=
UND
HEALING: IN VIVO EXPERIMENTAL STUDY
Erick Souza =
Neri[1] * Charton Frankson Madureira Nascimento Júnior[2]
* Taynara Camille Guilherme Lima[3] * Rafael Pires Moreira[4]
* Ana Rita Pinheiro Barcessat[5]
RESUMO
Objetivo: Avaliar =
os
efeitos tissulares de uma única aplicação da Terapia
Fotodinâmica em lesões induzidas em modelos experimentais, det=
erminando
sua influência na formação colag&e=
circ;nica
e na duração do ciclo celular. Método: Cinquenta
lesões induzidas em camundongos Mus Musculus
foram randomicamente tratadas com Terapia Fotodinâmica mediada por Az=
ul
de Metileno a 0,01% ativado por Laser vermelho 660 nm<=
/span>
(G1), Laserterapia sem fot=
ossensibilizador
(G2), Azul de Metileno a 0,01% (G3), Pomada dermatológica como contr=
ole
positivo (G4) e água destilada como controle negativo (G5), sendo
avaliados histologicamente quanto à deposição colagênica e áreas de
organização nucleolar após 72 horas do tratamento.
Resultados: Os grupos fotoativados apresentaram
diferença significativa quanto à deposição colagênica (p<0,05) pela coloraç&atil=
de;o
de Tricrômio de Mass=
on,
demonstrando evidências de redução do tempo de reparo.
Não houve diferença significativa (p> 0,05) pela
técnica AgNOR nas regiões organiz=
adoras
nucleolares. Conclusões: A Terapia Fotodinâmica e a fotobiomodulação por Laser apresentaram
evidência de deposição colagê=
;nica
já nas primeiras horas do processo de cicatrização, sem
necessariamente alterar a duração do ciclo celular local,
não exercendo aceleração no processo de
proliferação celular nas condições experimentais
avaliadas neste estudo.
Palavras-chave: Fototerapia; Fotoquimioterapia; Azul de Metileno;
Cicatrização; Ferimentos e Lesões.
ABSTRACT
Objective: To evaluate
the tissue effects of a single application of <=
span
class=3DSpellE>Photodynamic Therapy on lesions<=
/span> induced in experimental models, =
determining
their influence on collage=
n
formation and cell cycle
duration. Method: Fifty le=
sions
induced in Mus Musculus mice were randomly treated with 0.01% Methylene Blue
mediated Photodynamic
Therapy activated by 660 n=
m
Red Laser (G1), Lasertherapy without photosensitizer (G2), 0.01% Meth=
ylene
Blue (G3), Dermatological =
Ointment
as positive control (G4) and Distilled
Water as negative control (G5), being
histologically evaluated
for collagen deposition and
areas of nucleolar organization after 72 hours =
of treatment. Results: The photoact=
ivated
groups showed a significant difference regarding collagen deposition (p<0,05) by the Ma=
ssons
Trichrome Stain,
Keywords:
Phototherapy; Photochemotherapy;
Methylene Blue; Wound Healing; Wounds and Injur=
ies.
INTRODUÇÃO
A cicatrização
consiste em um processo complexo de eventos celulares, moleculares e
bioquímicos que visam obter a reparação tecidual, e
independente do agente responsável pela perda de integridade tecidua=
l,
pesquisas com inovações que facilitem a
cicatrização são de interesse em diferentes modalidade=
s clínicas
e cirúrgicas, especialmente considerando o número crescente de
casos que necessitam de cuidados especiais, como obesidade, doenças
crônicas de base, estado nutricional, imunológico e vascular, =
que
podem eventualmente interferir no microambiente tecidual.(1)
Considerando o impacto social e
econômico de feridas crônicas nos sistemas de saúde,
especialmente no âmbito do Sistema Único de Saúde (SUS)=
, e
seus impactos na vida dos indivíduos acometidos, como
reduções na qualidade de vida e desfechos graves como
amputações e morte, bem como impacto na saúde
pública e assistência à saúde como a
multirresistência a antimicrobianos (2), é
necessário repensar em alternativas de baixo-custo e com
benefícios a curto e longo prazo para o manejo dessas lesões.=
Didaticamente,
a partir do momento em que ocorre uma lesão no corpo humano, inicia-=
se
uma ação coordenada de três eventos-chave para o proces=
so
cicatricial: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de
remodelamento. Tais eventos dependem crucialmente das funções do fibroblasto,
célula que exerce um importante papel na manutenção da
Matriz Extracelular (MEC) conjuntiva, sintetizando elementos como fibronectina, proteases, glicosaminoglicanos, elastina
e principalmente o colá=
;geno (1,3).
De tal modo, a proliferação fibrobl&aacu=
te;stica
e a deposição de colágeno configuram-se como indicador=
es
importantes em estudos de cicatrização.
As Regiões Organizadoras =
de
Nucléolos, do inglês n=
ucleolar
organizer regions
(NOR), são estruturas localizadas no braço curto dos cromosso=
mos
acrocêntricos 13, 14, 15, 21 e 22, compostas por proteínas
A Terapia Fotodinâmica (TF=
D),
do inglês Photodynamic therapy (PDT) tem se destacado co=
mo uma
alternativa terapêutica promissora por promover danos à membra=
na
da célula-alvo através da interação entre uma f=
onte
de luz, um fotossensibilizador (FS) associados =
ao
oxigênio tecidual, gerando uma reação fotoquímica
que promove a produção de espécies reativas de
oxigênio (EROs), como o ânion
superóxido, o oxigênio singleto e outras espécies reati=
vas
que apresentam efeitos citotóxicos. (6-8)
A TFD exerce efeitos positivos
descritos na literatura contra células tumorais e amplo efeito
antimicrobiano contra bactérias, fungos, vírus e
protozoários, além de ser um método de baixo custo,
ausente de efeitos adversos e não apresentar até o momento ri=
sco
para o desenvolvimento de resistência microbiana.(7,8)
Entretanto, ainda não está claro se além da
ação descontaminante, a TFD poder=
ia
exercer algum benefício através de efeitos diretos em process=
os
cicatriciais, interferindo no ciclo celular e/ou na MEC.
Visando contribuir nas
evidências dessa intervenção como uma potencial
terapêutica no manejo clínico de lesões, especialmente
feridas complexas com ou sem contaminação, tanto em ambiente
ambulatorial quanto hospitalar, este estudo tem como objetivo avaliar os
efeitos tissulares de uma única aplicação da Terapia
Fotodinâmica mediada pelo fotossensibilizador
Azul de Metileno, durante o período inicial do processo de reparo
tecidual em modelo experimental in =
vivo.
MÉTODOS
Aspectos
Éticos
O presente estudo foi aprovado p=
elo
parecer nº 005/2015 do Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA), sendo realizado entre agosto de 2016 e julho de 2017 no
Laboratório de Estudos Morfofisiológicos e Parasitários
(LEMP) da Universidade Federal do Amapá (UNIFAP), obedecendo os
princípios éticos de experimentação animal,
conforme normas estabelecidas pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA).
Grupos experimentais
Trata-se de um estudo experiment=
al,
realizado a partir de lesões cutâneas induzidas em 25 camundon=
gos
da espécie Mus musculus,
família Muridae, raça Swiss, cedidos pelo biotério do
Laboratório de Toxicologia da Universidade Federal do Amapá ,
alocados e distribuídos de forma randomizada em 5 grupos de 5 animais
cada. Foram realizadas duas lesões em cada animal e cada lesão
recebeu um tratamento diferente, totalizando 50 lesões. Os camundong=
os
foram acondicionados em gaiolas individuais, com alimentação e
hidratação a vontade, e submetidos a controle de ciclos claro=
e
escuro, controle de temperatura e ruídos.
Os grupos experimentais foram: 1)
TFD: lesões tratadas com aplicação prévia de Az=
ul
de Metileno (AM) a 0,01% (
Indução das lesões e Eutanás=
ia
Os camundongos foram posicionado=
s em
decúbito ventral para a realização da tricotomia no do=
rso
com cortador de cabelo Oasis® OS-704 e assepsia local com
álcool a 70%.Os animais foram pesados e em seguida anestesiados com
Cloridrato de Quetamina (100 mg/kg) e Cloridrat=
o de Xilazina (10 mg/kg), administrados via intraperitonea=
l, em
seringas de insulina de 100UI com agulha descartável (13x4,5).
Para realizar as lesões,
utilizou-se o instrumento Punch Dermatoló=
;gico
Descartável - Paramount Blades, ponta at=
iva
redonda com dimensões 6x6x3 mm, obedecendo uma distância
mínima de 2cm entre cada ferida. Posteriormente foram avaliadas as
medidas da lesão por meio de um paquímetro (medidas lineares)=
e
por sonda milimetrada (medida da profundidade).
As lesões induzidas foram
tratadas obedecendo os seguintes parâmetros de laser vermelho: a)
Comprimento de onda -Λ-: 660 nm; b)
Potência: 40 mW; c) Energia: 3,6 J/ponto; d) Densidade de energia por
ponto: 90 J/cm²; e) Área do ponto: 0,04 cm²; f) Tempo por
ponto: 1,5 min; g) Número de irradiações: 01; h)
Número de pontos irradiados: 02; i) Densidade de potência: 1000
mW/cm². (7,9)
Após 72 horas do tratamen=
to
das lesões, realizou-se a eutanásia dos animais por meio de
superdosagem anestésica, observando-se o nível de profundidad=
e de
sedação: redução drástica dos reflexos
autonômicos da cauda, córnea e pálpebra, e perda de
consciência do animal. Para coletar o material para a análise
histológica, realizou-se a secção longitudinal do dors=
o necropsiado, seguido de fixação em paraformaldeído a 20% em solução
tampão de fosfato de sódio monobásico e fosfato de
sódio dibásico (anidro) de pH neu=
tro,
preparado com 24 horas de antecedência.
Processamento histológico e coloraçõ=
;es
especiais
As amostras foram fixadas por 24
horas e seccionadas no plano mediano para inclusão em parafina, segu=
ida
da imersão em por 10 minutos em solução tampão =
de
formol por duas vezes, a seguir procedeu-se a desidratação dos
tecidos por imersão em banho em cadeia crescente de etanol, iniciando
com etanol a 30% por 10 minutos, até atingir o banho com etanol
absoluto. Posteriormente, realizou-se banho com etanol/xilol a 50%, seguido=
s de
dois banhos em xilol e por fim a imersão=
em
parafina com ponto de fusão em 60º C, para confecç&atild=
e;o
dos blocos histológicos.
Neste estudo, para a
avaliação da proliferação celular foram realiza=
dos
3 cortes de 5µm para cada amostra estendidos em lâminas de vidro
lisas, onde aplicou-se a técnica de Regiões Argirofílicas
Organizadoras Nucleolares (AgNOR) modificada pr=
oposta
por Ploton e colaboradores(10), que
permite a visualização seletiva das NOR através da
impregnação por prata coloidal, sendo possível
observá-las na microscopia de luz como estruturas arredondadas na cor
preta ou marrom-café. (10,11)
A técnica AgNOR
consiste em desparafinização em x=
ilol
seguida de desidratação em banhos sucessivos de álcool=
e
solução de ácido acético/álcool e banho =
em
água corrente por 5 minutos. As amostras receberam soluç&atil=
de;o
de prata a 50 % e gelatina 1%, e submetidas a 45ºC em estufa por 30
minutos. Posteriormente, as amostras foram lavadas em água corrente
deionizada a 40°C, seguida de novas imersões em
soluções crescentes de álcool para
desidratação e receberam lamínula em meio de montagem
bálsamo do Canadá.
Para avaliação da
deposição de colágeno, outros 3 cortes de cada amostra
foram desparafinizados e hidratados, lavados em
água corrente deionizada por 5 minutos e colocadas em
solução de Bouin em estufa a 60&d=
eg;C
durante 60 minutos para iniciar a etapa de coloração especial=
de Tricrômio de Masson=
(TM),
permitindo demarcar em verde-azulado as á=
;reas
de deposição colagênica .
Após a lavagem em á=
;gua
corrente e lavagem em água destilada, as amostras foram coradas com
Hematoxilina Férrica de Weigert por 10 m=
inutos
seguida de uma nova lavagem em água corrente deionizada por mais 10
minutos, seguida da submissão em solução de Escarlate =
de Biebrich por 5 minutos, e em seguida submetidas em
água destilada equilibrada em solução de Ácido =
Fosfotúngstico-Fosfomolíbdico por 15 mi=
nutos.
Por fim, a coloraçã=
;o
por Azul de Anilina foi realizada durante 10 minutos, e posteriormente lava=
dos
em água destilada para submeter as amostras em solução=
de
Ácido Acético Glacial 1% durante 5 minutos. Após essa
etapa, realizou-se desidratação em cadeia crescente de &aacut=
e;lcool,
para diafanizar e montar as lâminas com lamínula e meio de
montagem. Posteriormente, os blocos foram encaminhados para a análise
histopatológica, realizada por um pesquisador alheio ao estudo.
Para análise considerou-se
como padrão a área de 36 mm² de cada lesão, sendo
expressos em aproximadamente 49984 pixels/cm a partir da
demarcação pelo Softw=
are
Image J. As contagens das NOR foram evidenciada=
s em
magnificação de 400x, e as áreas de
deposição colagênica na
coloração azulada pela coloração Tricrômio de Masson=
foram
evidenciadas na magnificação de 10x, fornecendo melhor contrastação dos demais elementos tecid=
uais
como citoplasmas, queratina e fibras intercelulares.
Ao final, foi feita a méd=
ia
aritmética simples das áreas coradas pelo Tricrômio
de Masson para determinar a presença de =
fibras
de colágeno em cada grupo, e em seguida foram realizadas
comparações múltiplas e para análises dois-a-do=
is
por meio do teste One-way ANOVA. Para a
coloração de AgNOR, considerou-se=
as
médias dos valores de quantificação de NOR por
área, e submetidas a comparações múltiplas e
análises dois-a-dois também por meio do teste One-way ANOVA.
RESULTADOS
Com base nos dados obtidos,
observou-se pela análise estatística que média de pont=
os
de NOR avaliados nos diferentes grupos experimentais aplicados neste estudo
não apresentaram diferenças estatisticamente significativas e=
ntre
si (ANOVA p>0,05), conforme apresentado na figura 1.
Figura 1=
- Média de pontos de NOR por grupo experimental
(ANOVA p>0,05). Análise dois-a-dois: Laser x Terapia
Fotodinâmica (p>0,05) Laser x Água Destilada (p<0,05) Az=
ul
de Metileno x Pomada Dermatológica (p>0,05) Azul de Metileno x
Água Destilada (p>0,05) Terapia Fotodinâmica x Água
Destilada (p<0,05) Laser x Pomada Dermatológica (p<0,05).
Fonte: Resultados da pesquisa.
Os tratamentos propostos avaliad=
os
pela coloração de AgNOR foram
equivalentes na análise estatística, indicando que a TFD
não interferiu reduzindo o tempo de ciclo celular. Entretanto, os gr=
upos
fotoativados (Laser e TFD) avaliados quanto à deposição de
colágeno pela coloração TM, apresentaram diferen&ccedi=
l;as
significativas (p<0,05) quando comparados aos demais grupos (AM, PD e AD=
),
se destacando entre os grupos experimentais, conforme dados apresentados nas
figuras 2 e 3.
Figura
2 - Média de Pixels por
área de marcação do Tricrôm=
io
de Masson por grupo experimental (ANOVA p<0,=
05).
Análise dois-a-dois: Laser x TFD (p<0,05) Laser x AD (p<0,05) =
AM x
PD (p>0,05) AM x AD (p>0,05) TFD x AD (p<0,05) Laser x PD (p<0,=
05).
![](3D"1247-Textodoartigo-PTHTML_arquivos/image004.jpg")
Fonte: Resultados da pesquisa.
Figura
3 - Fotomicrografia da
coloração por técnica de AgNOR e
Tricrômio de Masson<=
/span>
por grupo experimental. Observa-se pontos de NOR como estruturas intracelul=
ares
arredondadas na cor preta/marrom-café, e moderada marcaç&atil=
de;o
de colágeno pela mancha de Tricrômio de Masson na cor azul. TFD: Terapia fotodinâmica A=
M:
Azul de metileno PD: Pomada dermatológica AD: Água destilada.
Objetiva de Masson 10x e Objetiva de AgNOR 400x.
![](3D"1247-Textodoartigo-PTHTML_arquivos/image006.jpg")
Fonte: Resultados da pesquisa.
Nas condições
experimentais deste estudo, observa-se quanto ao padrão de
marcação da técnica de AgNOR uma
marcação equivalente na intensidade e localizaçã=
;o,
majoritariamente em fibroblastos, evidenciado mais no tecido conjuntivo qua=
ndo
comparado com o tecido epitelial. =
DISCUSSÃO
A fase de proliferaç&atil=
de;o
se intensifica simultaneamente com uma resposta imunológica local
atenuada dentro de 48 até 96 horas(3-4)
após ocorrer a lesão, justificando a coleta das amostras com =
72
horas de tratamento. O grupo Laser =
não
apresentou diferença estatisticamente significativa dos demais grupo=
s em
relação à duração de ciclo celular pela
técnica de AgNOR (p>0,05).
Entretanto, foram observadas pela
coloração TM uma área de deposição colagênica significativamente diferente (p<0=
,05)
quando comparados aos demais grupos (AM, PD e AD), vale considerar que o te=
mpo
experimental é de 72 horas majoritariamente se está diante de
fenômenos celulares e vasculares da fase inflamatória do repar=
o ,
no entanto evidenciam -se áreas de deposição
significativas, corroborando com evidências de estudos.(14,15)
demonstrando que o Laser aceler=
a a
reparação tecidual, estimulando a proliferação e
diferenciação fibroblástica,
aumentando a síntese e deposição de colágeno, d=
este
modo, enfatizamos os efeitos positivos do Laser em lesões cutâ=
neas
no que tange à deposição colag&ec=
irc;nica
, porém sem interferência em ciclo celular. A TFD mediada por AM foi avaliada
nos estudos de Silva et al.(16) que observaram reduç&atil=
de;o
da proliferação celular e da deposição colagênica, e o aumento da atividade apopt&oacu=
te;tica
e neovascularização, Lamarque et =
al.(17)
evidenciaram efeito citotóxico em fibroblastos, ativando genes
apoptóticos devido ao fotodano mitocondr=
ial, e
Heckenkamp et al.(18) observaram in vitro uma redução=
de
30% na proliferação e 47% na migração de fibrob=
lastos
com 72 horas de tratamento, e redução dos níveis de fa=
tor
de crescimento transformador beta 1 (TGF-β1) e fator de crescimento
Carneiro et al.(19) e=
Sperandio et al.(20) mostraram que com 72 =
horas
de tratamento, as lesões induzidas em ratos tratadas com Laser e TFD apresentaram crostas m=
ais
espessas, intensificaram a presença de tecido de granulaç&ati=
lde;o,
evidenciaram moderada deposição de colágeno e repitelização estatisticamente diferenc=
iada,
comparada aos demais grupos. Garcia et al.(21) e Rudenko
et al.(22) reforçam que a TFD interfere positivamente na
cicatrização nos estágios iniciais de reparo, aceleran=
do a
inflamação e aumentando a deposição de
colágeno, corroborando com os achados deste estudo.
Algumas revisões
sistemáticas(23-25) e estudos clínicos como o de M=
oura
e colaboradores (7) Nunes et al.(8) e Aspiroz
et al.(26) demonstraram a eficácia da TFD no tratamento de
lesões, com melhoras significativas na cicatrização
comparadas com grupos controles. Entretanto, é válido conside=
rar
a advertência de Deyhimi et al.(27)<=
/sup>
que a TFD usada no tratamento de feridas inibiria progressivamente a prolif=
eração
ou a viabilidade celular, o que não se pôde observar nas fases
iniciais de reparo, aqui avaliadas.
Sabe-se que a MEC exerce
várias funções regulatórias sobre a
função e viabilidade dos fibroblastos, por meio de sinais
parácrinos, citocinas e fatores de crescimento,(3,28) de =
tal
modo, Pazos e colaboradores (29)
demonstraram que, além dos efeitos no tecido-alvo, a TFD modula a ME=
C,
exercendo diversas alterações moleculares. Tedesco
e Jesus(30) enfatizam que alterações na MEC podem
ativar quinases reguladas por sinalização extracelular, exerc=
endo
efeitos fotobiomoduladores que intensificam a
proliferação celular. No presente estudo, foram observadas
alterações histológicas importantes para os grupos
Com base nos dados apresentados,
propomos como hipótese que a TFD gerou modulação tecid=
ual
a partir da geração das EROs,
desencadeando sinais parácrinos locais que levaram à
ativação de fibrócitos adj=
acentes
à lesão, estimulando um estado metabolicamente ativo dessas
células e consequentemente um efeito fotobiomod=
ulador
secundário da TFD, proporcionando maior síntese e
deposição de fibras de colágeno avaliadas atravé=
;s
da coloração TM.
CONCLUSÕES
A
Terapia Fotodinâmica avaliada por meio da coloração de =
AgNOR não demonstrou efeito sobre o ciclo celu=
lar
nas condições experimentais aplicadas neste estudo, apresenta=
ndo
efeito similar aos outros grupos no padrão de distribuiç&atil=
de;o
das Regiões Organizadoras de Nucléolos. Entretanto, feridas
tratadas com Terapia Fotodinâmica, bem como aquelas tratadas com fotobiomodulação por Laser apresentaram
evidências histológicas com potenciais benefícios na
redução do tempo de reparo, demonstrando deposiç&atild=
e;o colagênica aumentada no tempo de 72 horas ap&oa=
cute;s
o início do tratamento. Entretanto, ressalta-se a necessidade mais
estudos que visem esclarecer os mecanismos moleculares e histológicos
subjacentes da Terapia Fotodinâmica no reparo de lesões.
REFERÊNCIAS
Programa Institucional de Bolsas de
Iniciação Científica (PIBIC) – CNPq – Edit=
al
003/2018 DPQ/PROPESPG/UNIFAP
Autor
correspondente:
Submissão:
2021-09-27
Aprovado:
2021-11-23
[1] Enfermeiro.
Pós-graduando em Enfermagem do Trabalho. Universidade Federal do
Amapá Macapá - AP - Brasil ORCiD:
https://orcid.org/0000-0002-1754-1212 E-mail: erickneri13@gmail.com
[2] Enfermeiro. =
Universidade
Federal do Amapá Macapá - AP - Brasil OR=
CiD:
https://orcid.org/0000-0002-5406-8102 E-mail: chartonjr99@gmail.com
[3] Enfermeira.
Mestranda em Ciências da Saúde. Universidade Federal do
Amapá Macapá - AP - Brasil ORCiD:
https://orcid.org/0000-0002-6170-9609 E-mail: taycami43@gmail.com
[4] Doutorando em
Ciências Farmacêuticas. Universidade Federal do Amapá
Macapá - AP - Brasil ORCiD:
https://orcid.org/0000-0002-2236-5145 E-mail: hosktoff@hotmail.com
[5] Odontó=
;loga.
Doutora em Estomatologia Básica e Aplicada. Universidade Federal do
Amapá Macapá - AP - Brasil ORCiD:
http://orcid.org/0000-0002-5261-6435 E-mail: ritabarcessat@gmail.com=
=
&nb=
sp; =
&nb=
sp; =
&nb=
sp; =
&nb=
sp;